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垂直顯像SMI簡(jiǎn)介
垂直顯像SMI是1996年在SMI與SPDM的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出來(lái)的，能在納米等級(jí)上分析完整的3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡，有效的納米級(jí)光學(xué)分辨率，在解析2D圖像能達(dá)到5nm，而在解析3D圖像能達(dá)到40nm，所以比起以Abbe定律所算出來(lái)的物理極限200nm還要更佳。Abbe在1873年提出理論上光學(xué)顯微鏡的分辨率限制假說(shuō)。
垂直顯像SMI光學(xué)顯微鏡是由海德堡大學(xué)光學(xué)應(yīng)用與資訊處理博士克里斯托夫克勒梅所開(kāi)發(fā)出來(lái)，集結(jié)了定位光學(xué)顯微鏡(光學(xué)間距精密顯微鏡SPDM,Spectral Precision Distance Microscopy)結(jié)構(gòu)照明設(shè)備(空間調(diào)整照明設(shè)備SMI,Spatially Modulated Illumination)的科技。
自從2008年3月起，許多標(biāo)準(zhǔn)的螢光染劑像是綠色熒光蛋白(GFP)與Alexa螢光染劑可以應(yīng)用在SPDMphymod (可物理修飾螢光團(tuán)physically modifiable fluorophores)定位光學(xué)顯微鏡上，這種顯微鏡只有單一激光波長(zhǎng)才有適合的光強(qiáng)度能用在納米圖解上。[1]
垂直顯像SMI配置
SMI是特別的激光光學(xué)照明設(shè)備 (空間調(diào)整照明設(shè)備Spatially Modulated Illumination)與用Vertico反射垂直向的光，使之能夠分析固定住的標(biāo)本細(xì)胞也能分析光學(xué)分辨率在10納米甚致更少的活細(xì)胞 (1納米 = 1nm = 1 × 10m).
此項(xiàng)科技的特別之處與聚焦科技，例如4Pi光學(xué)顯微鏡相比，差在較寬視野能讓整個(gè)細(xì)胞能在納米等級(jí)的分辨率下完整的描繪出來(lái)。這種整個(gè)細(xì)胞的3D顯像技術(shù)在20µm × 20µm的范圍下，只需花2分鐘，寬視野的顯像能讓整個(gè)物體的照明與針測(cè)同時(shí)進(jìn)行。[1]
垂直顯像SMI空間調(diào)整照明設(shè)備
SMI 光學(xué)顯微鏡是建立在點(diǎn)分散函數(shù)工程的光學(xué)處理技術(shù)之上，用以修正顯微鏡的點(diǎn)分散函數(shù)(PSF) 來(lái)增加光學(xué)分辨率，使之能以波長(zhǎng)等級(jí)來(lái)測(cè)量螢光物質(zhì)的間距，分析其他結(jié)構(gòu)參數(shù)則能達(dá)到納米等級(jí)。
SMI顯微鏡在海德堡大學(xué)已經(jīng)達(dá)到下列成果: 每個(gè)物件照明的強(qiáng)度都不一樣，與傳統(tǒng)的寬視野螢光顯微鏡不同，而是以兩個(gè)相反方向的干涉激光光來(lái)調(diào)整空間的精確性，這種空間上的調(diào)整波長(zhǎng)原理是在1993 由Bailey et al發(fā)表。
SMI可以與其他超解析科技結(jié)合，像是與3D LIMON或是LSI-TIRF側(cè)向顯像技術(shù)而成全向內(nèi)部顯像。SMI 科技能允許讀出自動(dòng)螢光基團(tuán)(autofluorophore)分布在人類眼睛組織的光學(xué)圖像，這使用了3種不同激發(fā)波長(zhǎng)(488、568 、647nm)而能收集自動(dòng)螢光發(fā)出的光譜訊號(hào)，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在人類眼睛組織的斑點(diǎn)惡化上。[1]
垂直顯像SMI定位顯微鏡
SPDM (光學(xué)間距精密顯微鏡Spectral Precision Distance Microscopy)，定位光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)是螢光顯微鏡加上光學(xué)處理使得能測(cè)量"光學(xué)上分離"粒子的位置、距離與角度(例如:分子)光學(xué)顯微鏡的解析限制之下。 "光學(xué)上分離"指的是在一定的時(shí)間之內(nèi)的一點(diǎn)上, 只有單一粒子或是分子在特定的區(qū)域被傳統(tǒng)的光學(xué)分辨率下(大概是直徑200-250nm)偵測(cè)到。當(dāng)所有的分子在某個(gè)區(qū)域都含有不同的光學(xué)標(biāo)記就能實(shí)現(xiàn)(例如:不同的顏色或者不同粒子發(fā)射的不同激發(fā)光)
使用SPDM能達(dá)到結(jié)構(gòu)的解析且能偵測(cè)兩點(diǎn)間空間上的最短距離，位置則由粒子的不同光學(xué)特性定位(拓墣解析)。在合適的條件下，則是依定位的精確度, 粒子密度等等決定，"拓墣解析"則是對(duì)應(yīng)"空間頻率"。
SPDM 是一種定位顯微鏡能達(dá)到有效的光學(xué)解析較于傳統(tǒng)的光學(xué)解析(大概200-250nm)更佳，能顯出有效點(diǎn)像函數(shù)的值的一半寬，借由應(yīng)用合適的激光光學(xué)精密處理技術(shù)，位置與距離小于點(diǎn)分散函數(shù)(傳統(tǒng)上200-250nm) 的一半寬，且能被偵測(cè)目標(biāo)物與不同的光學(xué)訊號(hào)精確到納米等級(jí)。其中一項(xiàng)重要的應(yīng)用是在基因研究方面(研究基因體中有功能的部分)，另一項(xiàng)則是研究膜的構(gòu)造。
定位光學(xué)顯微鏡的其中一個(gè)里程碑是1996年次在3D納米等級(jí)上定位螢光物質(zhì)，也因此從理論上與實(shí)驗(yàn)上證明定位的精確度。[1]
垂直顯像SMISPDMphymod
在過(guò)去兩年有分子應(yīng)用在納米顯微研究，此分子能射出一樣光譜頻率的光(但在光學(xué)的閃光特性上則不同)且能像光學(xué)間距精密顯微鏡一樣借由光來(lái)調(diào)控能否射出光。能借由結(jié)合上千張相同細(xì)胞的影像且使用激光光譜精密測(cè)量來(lái)記錄定位的影像達(dá)到改善光學(xué)分辨率。應(yīng)用這種特別的納米顯微處理技術(shù)在過(guò)去是非常困難的，因?yàn)檫^(guò)去以為只有特殊制造的分子才能使用光來(lái)調(diào)控能否射出光。
在2008年3月，克里斯托夫克勒梅的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)在某種光學(xué)-物理?xiàng)l件下也可以使用許多標(biāo)準(zhǔn)螢光染劑GFP、Alexa染劑與螢光素分子，使用SPDMphymod (可物理修飾螢光團(tuán)physically modifiable fluorophores)技術(shù)，在適合的光強(qiáng)度下，單一激光則可以顯出納米級(jí)的影像。與其他需要兩條激光的定位顯微鏡不同，使用特別的光-調(diào)控/光-活化螢光分子。
GFP基因很早就被引進(jìn)而且表現(xiàn)在許多原核與真核生物中，由于他們發(fā)現(xiàn)與開(kāi)發(fā)GFP ，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)在2008年頒發(fā)給馬丁·查爾菲、下村脩與錢(qián)永健。標(biāo)準(zhǔn)螢光分子除了能應(yīng)用在SPMD上，還能應(yīng)用在許多其他的領(lǐng)域上像是生理學(xué),細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)等等。
SPDMphymod科技已經(jīng)能使用標(biāo)準(zhǔn)螢光染劑:GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488與螢光素。[1]
垂直顯像SMI納米等級(jí)光學(xué)顯微鏡
納米等級(jí)光學(xué)顯微鏡(LIMON Light MicrOscopical nanosizing microscopy) 在2001年海德堡大學(xué)發(fā)明，同時(shí)結(jié)合定位顯微鏡與空間調(diào)整照明設(shè)備在3D超解析顯微鏡上。
結(jié)合SMI與SPDM使垂直顯像SMI能繪出3D圖像，因此次SMI計(jì)劃與SPDM計(jì)劃始動(dòng)。SMI計(jì)劃決定粒子的中心與粒子的在顯微鏡軸的分散方向。然而粒子或分子的中心可以精確到1-2nm，分散離中心的程度可以被由軸直徑精確到30-40nm。
隨后，側(cè)向粒子或分子則采用SPDM來(lái)定位且能精確到納米等級(jí)。SPDM能達(dá)到每秒16楨與有效的2D分辨率精確到10nm;大概每2000楨能與SMI資料結(jié)合(所需時(shí)間大約10秒)而產(chǎn)生高分辨率的三維影像(有效的3D光學(xué)分辨率大概在40-50nm左右)。而使用快速照相機(jī)有些甚至能有較快的速率(達(dá)到每秒數(shù)百楨)。而使用合適的染劑能產(chǎn)生較好的3D解析影像。
應(yīng)用SPDMphymod結(jié)合SMI (兩者都在1996年由克里斯托夫克勒梅的實(shí)驗(yàn)室所發(fā)明) 利用3D雙重顏色重建Her2/neu與 Her3的排列模式，這些蛋白團(tuán)能被定位精確到25nm。[1]
垂直顯像SMI工業(yè)使用超解析顯微鏡
超解析顯微技術(shù)既能使用在生醫(yī)實(shí)驗(yàn)室還能應(yīng)用在制藥研究上，在辨識(shí)與判斷目標(biāo)物的價(jià)值上特別有用，例如: 生物分子裝置(BBM biomolecular machines) 都是由許多勝任基本功能的體細(xì)胞大分子所組成高度納米結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，依功能而決定特定的結(jié)構(gòu)，BBM的其中一個(gè)例子是擬核區(qū)，它讓兩米長(zhǎng)的DNA折疊在直徑只有幾微米的區(qū)域，因此DNA 才能在細(xì)胞中扮演訊息與調(diào)控的中心腳色。
借由使用LIMON 3D結(jié)合LIMON復(fù)合物標(biāo)定，使次做3D復(fù)合物如BMM的隱密蛋白質(zhì)或核酸能顯像且不破壞其結(jié)構(gòu)。直到現(xiàn)今，的問(wèn)題是在詳細(xì)分析內(nèi)部大分子時(shí)必須破壞復(fù)合物的構(gòu)造，所以有些利用電腦模型或者以核磁共振方式來(lái)模擬復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。[2]
參考資料
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