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三維光學(xué)顯微成像激光掃描共聚焦顯微成像
圖1 共聚焦顯微成像示意圖
在傳統(tǒng)的寬場(chǎng)顯微成像中，整個(gè)樣品被光源均勻地照亮，樣品不同位置發(fā)出的熒光同時(shí)被探測(cè)器接收，其中包括大量的焦面外的信號(hào)。在對(duì)厚樣品成像時(shí)，焦面上的信號(hào)只占探測(cè)信號(hào)的一小部分，因此圖像會(huì)非常模糊。不同與寬場(chǎng)成像，激光共聚焦顯微成像采用點(diǎn)掃描的方式，并且在探測(cè)器前成像焦面的共軛面上放置小孔，以阻擋焦面外產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)入探測(cè)器（如圖1所示）。由于小孔的作用，只有焦平面上的信號(hào)可以被探測(cè)到，因此這種成像方式具有層析能力。
共聚焦成像能夠獲取高質(zhì)量的圖像，目前被廣泛應(yīng)用在科學(xué)與工程領(lǐng)域中，其典型應(yīng)用包括生命科學(xué)、半導(dǎo)體檢測(cè)與材料科學(xué)。
三維光學(xué)顯微成像非線(xiàn)性光學(xué)顯微成像
三維光學(xué)顯微成像1. 雙光子激發(fā)顯微成像
雙光子激發(fā)顯微成像是利用雙光子激發(fā)的非線(xiàn)性效應(yīng)實(shí)現(xiàn)其內(nèi)在的層析能力的。雙光子激發(fā)的概念由Maria Goeppert-Mayer于1931年在她的博士論文中提出。
圖2 單光子與雙光子激發(fā)的能級(jí)和效果示意圖
熒光物質(zhì)同時(shí)吸收兩個(gè)光子后能夠激發(fā)出熒光光子，熒光光子的能量比這兩個(gè)光子的能力要高。由于同時(shí)吸收兩個(gè)光子的概率比較低，這種成像采用聚焦脈沖激光的方式來(lái)激發(fā)熒光，以在短時(shí)間內(nèi)在焦點(diǎn)處聚集大量的激發(fā)光子。雙光子激發(fā)依賴(lài)于同時(shí)吸收，激發(fā)的熒光強(qiáng)度正比于激發(fā)光強(qiáng)度的平方。這種非線(xiàn)性效應(yīng)使得只有在焦點(diǎn)處很小的體積內(nèi)能夠激發(fā)熒光，樣品其它區(qū)域不能夠激發(fā)熒光，因而這個(gè)成像方式具有內(nèi)在的層析能力。圖2中對(duì)比了單光子與雙光子激發(fā)的能級(jí)躍遷和激發(fā)效果。
雙光子激發(fā)通常采用近紅外波段的激光進(jìn)行激發(fā)，這樣成像的穿透深度比較深，光漂白也比較小，適合于對(duì)活體生物組織進(jìn)行非侵入式的光學(xué)成像。目前雙光子激發(fā)顯微成像被廣泛應(yīng)用在生理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、胚胎發(fā)育學(xué)中。
2.二次諧波顯微成像
圖3 二次諧波產(chǎn)生的能級(jí)示意圖
二次諧波（也稱(chēng)做“倍頻”）是一種非線(xiàn)性的光學(xué)效應(yīng)。在這種現(xiàn)象中，同一頻率的兩個(gè)光子與非線(xiàn)性材料進(jìn)行相互作用后被“結(jié)合”產(chǎn)生一個(gè)光子。這個(gè)光子具有兩倍的原光子的頻率，波長(zhǎng)精確地為原光子波長(zhǎng)的一半（如圖3所示）。二次諧波成像是基于二次諧波效應(yīng)的成像方法。與熒光成像的對(duì)比度來(lái)源于熒光分子密度不同，其對(duì)比度來(lái)源于樣品產(chǎn)生二次諧波能力的變化。
與雙光子激發(fā)成像一樣，二次諧波成像也使用近紅外波段的脈沖激光，因此二次諧波成像具有無(wú)需標(biāo)記和底損傷性的優(yōu)點(diǎn)，其常常與雙光子激發(fā)成像一起用來(lái)對(duì)活體組織進(jìn)行多模式成像。二次諧波具有偏振各向異性的特點(diǎn)，因此可以用于探測(cè)蛋白質(zhì)分子的排列方向。
三維光學(xué)顯微成像結(jié)構(gòu)光照明顯微成像
4 結(jié)構(gòu)光照明顯微成像示意圖
結(jié)構(gòu)光照明顯微成像是在寬場(chǎng)成像的基礎(chǔ)上發(fā)展出的三維層析成像方式。在這種成像方法中，照明光路中放置了光柵，最終在物鏡后成像焦面上產(chǎn)生了強(qiáng)度為正弦分布的照明。通過(guò)改變正弦分布的相位并記錄調(diào)制后的反射或熒光圖像可以提取出成像焦平面的圖像和抑制焦面外的模糊（如圖4所示）。這種層析能力的獲取是基于后期的計(jì)算處理。這種層析成像方法為后來(lái)的超分辨技術(shù)奠定了物理基礎(chǔ)。
由于只需要對(duì)傳統(tǒng)的寬場(chǎng)顯微鏡進(jìn)行照明光路的改進(jìn)便可以獲取層析能力，結(jié)構(gòu)光照明層析成像具有成本低的優(yōu)勢(shì)。目前發(fā)展的快速結(jié)構(gòu)光照明成像可用于對(duì)生物組織動(dòng)態(tài)事件進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
三維光學(xué)顯微成像光片照明顯微成像
圖5 光片照明顯微成像示意圖
光片照明顯微成像，也稱(chēng)作選擇性平面照明顯微成像。與傳統(tǒng)的落射式照明成像不同，這種成像方式是從樣品的側(cè)面進(jìn)行照明，照明方向垂直于探測(cè)方向。這樣樣品中只有一個(gè)薄層被照亮，使得成像具有層析能力，移動(dòng)光片的位置可以獲取樣品的三維圖像。產(chǎn)生光片的方式有主要有兩種：種是用柱透鏡使光束在一維上聚焦；第二種方式是在一維上掃描光束形成光片。
由于只有需要觀察的平面被照明，這種成像方法減少了對(duì)樣品的光漂白，適合應(yīng)于對(duì)樣品的長(zhǎng)時(shí)間的成像。另外由于使用面陣探測(cè)器進(jìn)行成像，其成像速度較快。目前，光片照明成像通常被應(yīng)用在發(fā)育生物學(xué)中，用以對(duì)胚胎的發(fā)育進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的觀察。
參考資料
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